کلمات کلیدی:
آنیون، کاتیون، حجم هیدرودینامیکی، یون
اگر شما مطلب مربوط به وزن مولکولی را خوانده باشید، (اگر نخوانده اید، اینجا کلیک کنید) به یاد می آورید که در یک نمونه ی پلیمری، مولکول ها وزن مولکولی یکسانی نخواهند داشت. در عوض، یک توزیع وزن مولکولی داریم. وزن مولکولی متوسط بیشینه ای وجود دارد که ما آن را وزن مولکولی متوسط عددی ، یا mn می نامیم (در اینجا مثالی از محاسبه ی وزن مولکولی برای پلیمرها آمده است). البته همواره زنجیره هایی از پلیمر وجود دارند که دارای وزن های بیشتر و کمتر از وزن مولکولی متوسط عددی هستند. اگر ما نموداری رسم کنیم که وزن مولکولی پلیمر، روی محور x ها، و تعداد زنجیره هایی که وزن مولکولی خاصی دارند روی محور y ها باشد، به نموداری شبیه به این خواهیم رسید:
(بله، میدانم که نمودارهایی مثل این را معمولا به گونهای میکشند که وزن مولکولی از راست به چپ افزایش مییابد. اما به دلیلی که تا چند لحظهی دیگر به آن اشاره خواهیم کرد، افزایش وزن مولکولی از چپ به راست نشان داده شده است.)
یک راه برای دستیابی به نموداری نظیر این، استفاده از کروماتوگرافی اندازه طردی، یا SEC است. اما SEC در حقیقت وزن مولکولی را اندازهگیری نمی کند، بلکه حجم هیدرودینامیکی را می سنجد. این حجم، بزرگی زنجیره ی پلیمری در هم تنیده را، در محلول نشان می دهد. پس در این روش وزن مولکولی به صورت نسبی اندازه گیری می شود، چرا که مسلم است که هرچه وزن مولکولی پلیمری بیشتر باشد، حجم هیدرودینامیکی آن نیز بیشتر خواهد بود.
ولی گاهی نیاز است که توزیع وزن مولکولی را به طور دقیق بدانیم. در نتیجه، این کار بر عهده ی برخی دانشمندان مبتکر گذاشته شد تا چیزی را اختراع کنند که ما آن را «طیف سنجی جرمی واجذبی/یونشی لیزری به کمک ماتریس» (یا matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectroscopy )، یا به اختصار طیف سنجی جرمی MALDI می نامیم.
حال، این روش خارق العاده که MALDI نامیده می شود چیست؟ برای توضیح این موضوع، ما فرآیند MALDI را از اول تا آخر بررسی می کنیم تا ببینیم دقیقاً چگونه رخ می دهد. قبل از هر چیز، پلیمر را در یک حلال حل می کنیم. چه نوع حلالی؟ این امر کاملاً بستگی دارد. نخستین آزمایش های MALDI بر روی پروتئین ها انجام گرفت. از آنجایی که پروتئین ها در آب محلول هستند، از این رو آب حلال اصلی بود. معمولاً از نسبت ۷۰ به ۳۰ از آب و استونیتریل (برای دیدن ساختار سه بعدی آن روی تصویر کلیک کنید) استفاده می شد. در حقیقت، حلال مصرفی شما کاملاً به نوع حلالی بستگی دارد که پلیمر مورد مطالعه ی شما را حل می کند.
همچنین عامل ویژه نیز اضافه میشود. این عامل ویژه ترکیبی مانند ترانس– سینامیک اسید یا ۵,۲-دی هیدروکسی بنزوییک اسید است. البته از پلیمری به پلیمر دیگر، این ماده متفاوت است، ولی نکتهی مهم این است که عامل ویژهی ما باید اشعهی ماوراءبنفش را جذب کند. معمولاً جاذب ماوراءبنفش را حدود ۱۰۴ برابر بیشتر از پلیمر در محلول میریزیم.
باز هم اگر روی این دو ترکیب کلیک کنید، ساختار آنها را در حالت سه بعدی خواهید دید. وقتی که تمام اینها با هم مخلوط شدند، نمونه در یک محفظه کاملا بسته ، در نوک میله (probe) مخصوص نمونه قرار می گیرد (به تصویر زیر نگاه کنید). سپس به وسیله ی یک پمپ خلأ تمام هوا، یا تقریباً تمام هوای داخل محفظه را خارج می کنیم. هنگامی که این مرحله به پایان رسید، حلال تبخیر می شود و ما لایه ای از ترکیب جاذب ماوراء بنفش به همراه مقدار کمی پلیمر در آن خواهیم داشت. برای بیان بهتر می گوییم که اکنون پلیمر در یک ماتریس از ترکیب جاذب ماوراءبنفش پراکنده شده است. دلیل اینکه ما چنین روشی را طیف سنجی جرمی واجذبی/ یونشی لیزری به کمکماتریس می نامیم نیز همین است.
آیا کسی اسمی از لیزر آورد؟ درست است، در این مرحله ما نور لیزر به نمونه می تابانیم. معمولاً از یک لیزر ماوراءبنفش در بازه ی ۳۶۰-۳۳۰ نانومتر استفاده می کنیم. به یاد داشته باشید که نمونه ی ما کاملاً با ماده ی جاذب ماوراءبنفش پر شده است. این ماده، اشعه ی ماوراءبنفش را دوست دارد، و نمی تواند مقدار کافی از آن را به دست آورد؛ بنابراین تا حد امکان از لیزر انرژی جذب می کند. البته، مقداری از این انرژی را هم به مولکول های پلیمر می دهد.
همچنین، مادهی ماتریس به روش خاصی با پلیمرها واکنش میدهد و پلیمرها را به یونهایی باردار تبدیل میکند. دانشمندان به درستی نمی داند که این عمل چگونه صورت میپذیرد، اما اهمیت یونی شدن پلیمرها در ادامه بیان خواهد شد.
ابتدا بیایید به انرژی که پلیمرها از مادهی ماتریس جذب میکنند، توجه کنیم. هنگامی که آنها تمام این انرژی را جذب کردند، برخی از مولکولهای پلیمر کاری میکنند که پلیمرها تقریباً هرگز انجام نمی دهند. آنها بخار میشوند. معمولاً مولکولهای پلیمر برای بخار شدن بسیار بسیار بزرگ و سنگین هستند، ولی در دماهای بالا و فشارهای پایینی مثل این، آنها قادرند چنین کاری را انجام دهند. از همین جاست که واژهی واجذب یا دفع وارد نام این روش طیف سنجی میشود.
حالا که مولکولهای پلیمر در فاز گازی شناور هستند، وقت آن است که مطلب مهمی را دربارهی این محفظه بدانیم. در سر محفظه، جایی که مولکولهای پلیمر را بخار میکنیم، دو الکترود داریم؛ یک کاتد مثبت، و یک آند منفی. بر اساس اینکه چه نوعی از پلیمر و مادهی ماتریس به کار برده باشید، پلیمرها میتوانند یونهای کاتیونی یا آنیونی باشند. در اینجا ما فرض میکنیم که پلیمر مورد بررسی ما، کاتیونهای مثبت تشکیل میدهد.
حالا وقتی پلیمر را بخار میکنیم، دقیقاً آن را بین دو الکترود به گاز تبدیل میکنیم. زمانی که پلیمر ما، کاتیون تشکیل میدهد، کاتد مثبت را درست پشت نمونه، و آند منفی را روبروی آن قرار میدهیم (مجدداً، نگاهی به طرح دستگاه بیاندازید). مسلماً، پلیمرهای باردار و مثبت به سمت آند میروند و جذب بار منفی آن میشوند. اگر این کار را به درستی انجام دهیم، میتوان از این شتاب برای پرتاب مولکولهای پلیمر به سمت آشکارسازی استفاده کرد که در انتهای دیگر محفظه قرار دارد.
اکثر اوقات، هر مولکول پلیمر فقط دارای یک بار مثبت است. یعنی وقتی مولکولهای پلیمر در میدان الکتریکی بین دو الکترود، در حال شتاب گرفتن هستند، به هر مولکول پلیمر، نیروی یکسانی اعمال میشود. ولی به یاد داشته باشید که مولکولهای پلیمر جرمهای متفاوتی دارند.
ایزاک نیوتن دربارهی جرم، نیرو، و شتاب چه گفت؟
F = ma
به عبارت دیگر، نیرو مساوی است با جرم ضرب در شتاب. ولی میتوان این معادله را به شکل زیر نیز مرتب نمود:
بنابراین، برای آن نیروی یکسان که گفته شد، هر چه جرم بیشتر باشد، شتاب کمتری خواهیم داشت. و این یعنی مولکولهای پلیمر که سنگین و بزرگ هستند، زمان طولانی تری برای رسیدن به آشکارساز انتهای محفظه لازم دارند.
پس پلیمرها به آشکارساز برخورد میکنند، ابتدا کوچک ترها، و سپس مولکولهای بزرگ تر، کاملاً به ترتیب جرم. تمام مولکولهای پلیمر با وزن مولکولی یکسان، با هم به آشکارساز میرسند. هنگامی که آنها به آشکارساز برخورد میکنند، آشکارساز یک پیک را ثبت میکند. اندازهی پیک متناسب با تعداد مولکول هایی است که همزمان به آشکارساز برخورد میکنند. در انتها مجموعهای از پیکها را خواهیم داشت، مانند این:
زمانی که طول می کشد تا مولکولی به آشکارساز برخورد کند، با جرم آن متناسب است. بنابراین آنچه که در حقیقت به دست می آوریم، نموداری است که وزن مولکولی را روی محور x ها و تعداد مولکول های با وزن مولکولی داده شده را روی محور y ها نشان می دهد. بنابراین ما به توزیع وزن مولکولی دست یافتیم. رأس پیک ها را نقطه به نقطه به هم وصل کنید تا به یک منحنی دست یابید که بسیار شبیه به اولین منحنی این صفحه است.
SEC و MALDI
نکته ی ظریفی که ممکن است متوجه آن شده باشید، این است که در این نمودار وزن مولکولی از چپ به راست افزایش می یابد. در یک نمودار SEC،که بیش تر از MALDI با آن مواجه می شوید، وزن مولکولی از راست به چپ افزایش می یابد.
(می توانید بگویید چرا این گونه است؟) این موضوع می تواند گاهی مسائل را پیچیده کند، بدین سبب آن را به خاطر بسپارید.
با این حال، اختلاف های مهم تری بین MALDI و SEC وجود دارد. SEC یک نمودار توزیع وزن مولکولی تقریبی به شما می دهد، زیرا در این روش، حجم هیدرودینامیکی اندازه گیری می شود، نه وزن مولکولی. در نتیجه ما می توانیم وزن مولکولی را تقریب بزنیم، آن هم از طریق مقایسه ی حجم هیدرودینامیکی پلیمر مورد مطالعه با یک استاندارد، که معمولاً پلیاستایرن است و ما برای آن رابطه ی دقیق بین حجم هیدرودینامیکی و وزن مولکولی را داریم. این کار فقط یک تقریب در اختیار ما می گذارد، زیرا رابطه ی بین وزن مولکولی و حجم هیدرودینامیکی، همواره برای هر پلیمری یکسان نیست.
اما MALDI جرم را دقیق تر اندازه گیری می کند، زیرا پلیمر تحت بررسی شما را با هیچ چیزی مقایسه نمی کند و اندازه گیری مطلقی از جرم را در اختیارتان می گذارد. به این دلیل، با گذشت زمان، احتمالا MALDI جای SEC را در اکثر آزمایشگاه ها خواهد گرفت.
مراجع
Creel, Howard, Trends in Polymer Science, Elsevier, 1993, vol.1, no.11, pp.336-342 “Prospects for the Analysis of High Molar Mass Polymers Using MALDI Mass Spectrometry”.
سلام میخواستم بدونم نسبت ماده به ماتریس و غلطت هرکدوم چقدر باید باشه دانشگاه شهیدبهشتی برای من مالدی گذاشت ولی پیکی مشاهده نشد درصورتیکه من از پپتیدم کلی جوابهای مختلف از آزمایشهای مختلف گرفتم
خیلی ممنون از مطالب خوبتون میشه منبعش رو بفرمائید از کجا هست لطفا؟
عالللللللللللللللی
سلام
این دستگاه تو ایران هست؟
بله سه عدد وجود داره که بر اساس شنیده ها متاسفانهفقط یکی سالم و فعاله، در پژوهشکده گیاهان و مواد اولیه دارویی دانشگاه شهید بهشتی تهران
سلام. چرا روش مالدی برای اندازه گیری میانگین عددی جرم مولکولی Mnاستفاده میشه ؟ ولی برای میانگین وزنی جرم مولکولیMw استفاده نمیشه؟
خیلی خوب بود ممنون